看这里！你所需要的微量RNA建库手册

转录组测序是目前应用最广泛的高通量测序技术之一，能够从全基因组整体转录水平研究基因功能，揭示特定生物学过程或疾病发生过程中的分子机制。目前常规转录组测序文库制备方案通常需要100 ng以上的RNA起始量，然而在实际的科研实验中，对于一些难扩培的微量细胞或者从组织上直接分离下的少量细胞，特殊的组织，血清/血浆以及外泌体等样本，能够获取足够多的RNA十分困难。

“令人头大”的特殊微量RNA

常见的微量RNA主要来源于血清/血浆样本、外泌体样本、穿刺组织样本、单细胞样本等等。下图1为来源于血清样本与外泌体样本的RNA质检峰图。

图1  血清RNA及外泌体RNA

从图上可知此类样本高度片段化且RNA浓度低。常规转录组建库技术会先对总RNA样本进行rRNA的去除，该过程涉及了酶切消化及磁珠纯化等步骤，如果样本RNA起始量太低，则难以建库成功。为了保证微量RNA样本能够顺利建库测序，又考虑到血清血浆及外泌体来源的RNA样本中rRNA含量较常规样本低，通常的做法是取消rRNA的去除步骤以保证建库成功率，但往往rRNA的残留率不可控，数据质量也不尽如人意。那么，是否有更好的解决方案呢？

“非同一般”的RNA建库模式

吉赛生物NGS团队针对上述困难，找到了相对完善的解决方案：将SMART（Switching Mechanism At 5' end of RNA Template）技术应用于微量RNA全转录组建库测序。

技术流程如下图3所示，分离提取的总RNA经过片段化后，加入带有一段特定序列的随机引物和LNA-TSO模板转换引物，进行cDNA第一链合成，随后进行一轮PCR预扩增合成双链cDNA文库。紧接着，采用特别的黑科技Zap R v2& R-Probes，在合成双链cDNA文库后去除rRNA来源的cDNA，再经过PCR扩增即可完成文库构建。

图2  SMART微量建库技术流程（以上图片来自Takara）

与传统转录组建库技术相比，该方法结合了SMART技术和LNA（Locked Nucleic Acid）技术，提高了模板转换反应稳定性，同时带有方向信息的模板转换反应保留了RNA的链来源信息，绕开了前处理中的rRNA去除及磁珠纯化等步骤，提高了建库成功率，也提高了后期的数据质量，能获得包含mRNA/LncRNA/circRNA在内的更多更全面的信息。目前，该方法的最低起始量为250pg，大大解决了科研工作者样本量少临床样本缺又难收集的难题。

“实战经验”之数据分享

我们采用了同一组血清外泌体RNA样本，分别用两种方法进行了建库测序。基于相同的建库起始量（5ng），同等测序深度（~30M reads）下，常规建库方法测序数据基因组匹配率约30%-50%，而SMART微量建库技术测序数据匹配率能达80%以上（图3）。

图3  两种建库方法数据对比

从rRNA的残留率来看，常规建库方法由于省略了rRNA去除步骤， rRNA 残留率不可控，跟原始样本中rRNA占比相关，较低的比例在10%左右，有些较差的样本比例可能去到80%~90%。而微量建库方法增加去rRNA步骤，可将rRNA控制在5%以内，整体数据质量明显提高，可以在低起始量的情况下，获得高灵敏度、高重复再现性的结果，更易获得完整且准确的信息。

看到这里，不少小伙伴不禁会心动地问：那微量RNA样本是否也可以做circRNA测序呢？对此，吉赛生物技术团队也做了技术突破，给了一个肯定的答案：在保证足够RNA样本起始量的情况下，先将微量RNA样本进行线性RNA去除，富集circRNA后采用SMART微量建库模式进行文库构建，从而实现微量样本的circRNA测序。

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